Volume 6, Dicembre 2000, Numero 4

A. Iannitelli, L. Aloe, C. Zucca, C. Di Biasi, G.F. Gualdi, G. Bersani - Vol. 6, Dicembre 2000, num.4

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Articolo regolare/Regular article

Anomalie neuroevolutive cerebrali studiate con Risonanza Magnetica Nucleare e livelli plasmatici di
Nerve Growth Factor in età adulta in pazienti con schizofrenia
Brain neurodevelopmental abnormalities studied by means of magnetic resonance imaging and NGF blood levels in adult schizophrenic patients

A. Iannitelli, L. Aloe*, C. Zucca, C. Di Biasi**, G.F. Gualdi**, G. Bersani

III Clinica Psichiatrica, * Istituto di Neurobiologia, CNR, Roma,
** I Clinica Medica Unità TC-RMN, Università di Roma "La Sapienza"

Parole chiave: Neurosviluppo • Schizofrenia • Neurotrofine • NGF • Brain imaging • RMN
Key words: Neurodevelopment • Schizophrenia • Neurotrophins • NGF • Brain imaging • MRI

Introduzione

Negli ultimi anni, l'ipotesi di una alterazione del neurosviluppo è stata ritenuta come una delle più promettenti per la comprensione dei meccanismi patogenetici della sindrome schizofrenica (1-3). A favore di questa ipotesi vi sono numerosi dati provenienti dalla ricerca genetica (4,5) e da quella tesa alla individuazione di fattori ambientali che, da soli o in associazione ad una diatesi genetica, contribuirebbero ad un aumento di rischio per lo sviluppo della schizofrenia in età adulta. Tra i fattori ambientali vanno ricordate le complicanze ostetriche peri- e pre-natali, i fattori infettivi, tossici o stressanti agenti durante il periodo gestazionale, soprattutto nel II trimestre (6-9). Anche i quadri di neuropatologia, per esempio l'assenza di gliosi o i quadri di cosiddetta "atrofia" frequentemente confermati con le tecniche di brain imaging strutturale e funzionale, sono a favore di un maldevelopment cerebrale nella schizofrenia (3,10,11).

I dati di letteratura dimostrano che le alterazioni cerebrali nella schizofrenia sono presenti in numerose aree, anche se con una frequenza ed una gravità differenti. La corteccia prefrontale (3,12), la corteccia entorinale (13), il lobo temporale (14), il cervelletto (15), il corpo calloso (16,17), il setto pellucido (18), il complesso ippocampo-amigdaloideo (19-21) e lo striato (22,23) ricoprirebbero un ruolo importante nella patogenesi della sindrome. Come queste alterazioni si producano, quale "peso" ricoprano gli agenti eziologici implicati, quale sia il loro rapporto con i meccanismi patogenetici della malattia, è noto in modo incompleto.

Il NGF (Nerve Growth Factor) è il primo fattore neurotrofico scoperto (24), è quello più studiato ed è quello per il quale è stato riconosciuto un ruolo nella risposta allo stress psichico (25), nella modulazione endocrino-immunitaria (26), nella crescita, nello sviluppo e nelle eventuali alterazioni neuroevolutive di alcune delle aree cerebrali implicate nella schizofrenia, quali la corteccia entorinale (13).

Esistono alcuni studi sul possibile ruolo giocato dalle neurotrofine, in particolare dal NGF, nella schizofrenia (27-30). Questo filone di ricerca nasce dalla considerazione che il NGF, come fattore trofico, è implicato nella crescita, nello sviluppo e nella direzione assonale dei neuroni durante le prime fasi dello sviluppo cerebrale e che una alterazione nella sintesi e/o nell'utilizzo di questo fattore, possa contribuire alla definizione di quei quadri di maldevelopment cerebrale riscontrabili nella schizofrenia adulta. Infatti, alcune delle aree più frequentemente alterate nella schizofrenia sono quelle che maggiormente esprimono o utilizzano il NGF (31). In un recente lavoro, abbiamo osservato che i livelli plasmatici di NGF sono più bassi negli schizofrenici rispetto ai controlli sani; inoltre, negli schizofrenici non vi è correlazione con l'età a differenza dei sani dove la distribuzione della neurotrofina si comporta seguendo l'età del campione in studio (32).

Scopo del presente lavoro è stato quello di valutare, in soggetti schizofrenici adulti, le eventuali correlazioni tra livelli plasmatici di NGF e le dimensioni, studiate con Risonanza Magnetica Nucleare (RMN), di quelle strutture cerebrali più frequentemente alterate nella schizofrenia e che più di altre sono controllate dalla sintesi e/o utilizzo di NGF; verificare l'eventualità di una correlazione tra livelli plasmatici di NGF ed età di insorgenza della malattia, nell'ipotesi che un esordio precoce possa in qualche misura essere connesso al grado di anomalie neuroevolutive determinate anche da ridotti livelli di NGF.

Materiale e Metodi

Il campione

È stato studiato un campione costituito da 24 soggetti maschi con diagnosi di Schizofrenia secondo i criteri del DSM-IV (Schizofrenia paranoidea, N = 8; Schizofrenia indifferenziata, N = 7; Schizofrenia catatonica, N = 5; Schizofrenia disorganizzata, N = 4). Il range d'età varia dai 18 ai 46 anni, l'età media è di 28,17 anni (DS = 8,53). L'età di esordio della malattia è in media di 19,08 anni (range: 13-27; DS = 3,99); la durata di malattia è in media di 9,08 anni (range 0-25; DS = 7,54).

I soggetti sono stati studiati durante il loro ricovero presso il reparto della III Clinica Psichiatrica dell'Università di Roma "La Sapienza", durante il quale sono stati sottoposti ad esame di RMN cerebrale ed a prelievo ematico per dosaggio del NGF.

Sono stati inclusi nello studio soggetti, in assenza di comorbidità psichiatrica, con anamnesi negativa per patologia medica e/o neurologica, abuso di alcol e stupefacenti. I soggetti erano in wash-out da neurolettici da almeno 15 giorni ed in precedenza avevano assunto neurolettici, a dosaggio congruo. Inoltre, in alcuni soggetti, si trattava dell'esordio della malattia e, quindi, il trattamento con neurolettici era iniziato, per la prima volta, durante il ricovero. Tutti i soggetti hanno dato il loro consenso informato allo studio.

Prelievo e dosaggio del NGF

Tra le ore 9.00 e 10.00 a.m. è stato eseguito un prelievo di 10 cc di sangue. Il sangue è stato immediatamente centrifugato a 3000 rpm per 15' ed il plasma congelato a -20 °C. Il NGF è stato dosato, in cieco, in un'unica sessione con metodo ELISA (33).

Tecnica RMN utilizzata

L'intero campione è stato sottoposto a RMN cerebrale. L'apparecchiatura utilizzata è una RMN Magnetom Siemens operante ad alto campo, con potenza del magnete di 1.5 Tesla. Sono state eseguite sezioni nei tre piani dello spazio, utilizzando sequenze di tipo spin-echo (SE) ed inversion recovery (IR), pesate in T1, T2 e in densità protonica (DP). Le aree studiate sono state il complesso ippocampo-amigdaloideo, il giro temporale superiore, i gangli della base (caudato e putamen), il corpo calloso, il setto pellucido, il cervelletto e la corteccia prefrontale.

Le sezioni sagittali SE pesate in T1 (tempo di ripetizione TR = 600 msec, tempo di eco TE = 15 msec) sono state effettuate con uno spessore delle fette di 4 mm. La sezione sagittale mediana è stata utilizzata per lo studio del corpo calloso, della corteccia prefrontale e del cervelletto ed è riconoscibile in quanto mostra distinti limiti tra corpo calloso e sostanza cerebrale vicina, un chiaro corso dell'acquedotto di Silvio, la visualizzazione della ghiandola pineale e di quella pituitaria ed una precisa delimitazione delle creste dei giri corticali anteriori e posteriori al corpo calloso.

Le immagini coronali pesate in DP (TR = 2400 msec, TE = 15-90 msec), effettuate anch'esse con spessore di 4 mm, sono state utilizzate per lo studio delle strutture del lobo temporale e del setto pellucido.

Le immagini coronali IR pesate in T1 (TR = 600 msec, TE = 15 msec) sono state effettuate con uno spessore di 4 mm, orientate secondo un piano parallelo al tronco cerebrale; queste sezioni sono state eseguite per la valutazione morfologica dell'amigdala, dell'ippocampo e del giro temporale superiore (GTS).

Le sezioni IR secondo piani assiali sono state effettuate per evidenziare le anomalie della citoarchitettonica; la sequenza IR è infatti in grado di fornire un notevole contrasto tra sostanza bianca e grigia. Queste sezioni sono state utilizzate per la valutazione dei gangli della base.

Tutte le misurazioni sono state eseguite in cieco rispetto alla diagnosi. Le misurazioni lineari sono state eseguite manualmente, con lente millimetrata. Per tutte le aree per le quali la determinazione di indici di atrofia ed il metodo di misurazione lineare erano supportati da dati di letteratura si è proceduto, come da indicazioni metodologiche raccolte, alla misurazione lineare delle aree in studio e alla valutazione dei relativi indici (ippocampo, amigdala, giro temporale superiore, gangli della base, corpo calloso); per altre aree sono stati individuati nuovi indici cerebrali e nuovi metodi di misurazione lineare, basandosi sulla individuazione di indici e di misurazioni già eseguite su altre aree cerebrali (cervelletto, setto pellucido, Biputamen Ratio); per altre strutture, invece, per le quali misurazioni lineari risultavano difficili o non congrue per il nostro obiettivo di studio, con un programma di misurazione semiautomatico (Bioscence Software Research) si è valutata l'area e/o il volume (corpo calloso e giro temporale superiore). Le misurazioni sono state eseguite da due operatori. Il valore di interrater-reliability è stato di 0,9. Tutte le misure sono state corrette in considerazione dell'unità di misura dell'immagine di RMN utilizzata.

Prima di procedere all'elaborazione statistica per tutte le misurazioni effettuate, sono state eseguite delle correzioni, relative alla variabilità individuale, delle strutture esaminate usando la seguente formula:

misure lineari corrette di LS =	LS	x K

	LCI

LS indica il valore della dimensione esaminata (per es.: h dell'ippocampo, diametro antero-posteriore del corpo calloso, ecc.), LCI rappresenta la Larghezza Cerebrale Individuale (per il piano della misurazione) e k è una costante (= 100).

Complesso Ippocampo-Amigdaloideo

Le altezze dell'amigdala destra (hAdx) e sinistra (hAsn) sono state misurate in sezione coronale (34). Come riferimento è stata scelta la sezione coronale centrale che tangeva la commissura anteriore. In direzione posteriore, la sezione successiva mostra il complesso amigdala-ippocampo che, per convenzione, può essere considerato come amigdala, mentre, ancora in direzione postero-anteriore, dal momento della comparsa dei corpi mammillari, si può osservare l'ippocampo posteriore che, per convenzione, viene misurato quale ippocampo, in accordo con Bogerts et al. (35).

Le altezze dell'ippocampo destro (hIdx) e dell'ippocampo sinistro (hIsn) sono state misurate in sezione coronale. È stata scelta la sezione coronale parallela al piano del tronco cerebrale dove la formazione ippocampale è più alta; è stata considerata come altezza la maggior distanza supero-inferiore dell'ippocampo. Sulla stessa sezione è stata misurata anche la larghezza cerebrale, considerata come la massima distanza tra le tavole interne del calvarium (12).

Giro Temporale Superiore

Immagini coronali T1 pesate sono state utilizzate per la misurazione volumetrica del Giro Temporale Superiore anteriore destro (VGTSdx) e sinistro (VGTSsn). La corteccia e la sostanza bianca del Giro Temporale Superiore (GTS) sono state misurate in tre consecutivi piani coronali: due sezioni coronali in cui si vede l'amigdala più la successiva sezione anteriore (quando non è stato possibile separare precisamente l'amigdala dall'ippocampo sono stati considerati come punti di repere i tratti ottici e il chiasma). La corteccia e la sostanza bianca del GTS sono state delimitate superiormente dalla scissura silviana, inferiormente dal solco temporale superiore e medialmente da una linea che unisce il fondo del solco temporale superiore al solco circolare dell'insula (nel fondo della scissura silviana). Le tre aree del GTS, ottenute automaticamente dopo aver delineato queste sezioni, sono state moltiplicate per lo spessore delle fette (slices di 4 mm) al fine di ottenere il volume di ogni fetta. Infine, i volumi delle tre fette sono stati sommati: questo volume finale, non rappresenta ovviamente il volume dell'intero GTS (per la completa misurazione del quale si dovrebbero effettuare tali misurazioni in tutte le 7-8 fette coronali di 4 mm che passano per il GTS) ma rappresenta il volume della porzione anteriore del GTS che contiene il Giro di Heschl (36).

Gangli della base

I gangli della base sono stati studiati in sezione assiale IR (Fig. 4). Sono state individuate quelle sezioni assiali in cui erano contemporaneamente ben visibili (per un ottimale contrasto tra sostanza bianca e sostanza grigia) i nuclei caudato, putamen e pallido e la capsula interna con i suoi bracci anteriore, posteriore e ginocchio. Su queste sezioni sono state misurate le larghezze del caudato destro (lCdx) e del caudato sinistro (lCsn), del putamen destro (lPdx) e del putamen sinistro (lPsn). Le misurazioni sono state eseguite per il caudato lungo una linea immaginaria che unisce i punti più vicini della testa dei due caudati; per i due putamen, lungo una linea immaginaria passante per la distanza minima tra i due nuclei. Da queste misurazioni sono stati estratti i seguenti indici: BCR (distanza minima tra i nuclei caudati destro e sinistro/larghezza del cervello misurata su tale distanza 100); BFR (distanza tra i corni frontali destro e sinistro/larghezza del cervello misurata lungo tale distanza 100); BPR (distanza minima tra i nuclei putamen destro e sinistro/larghezza del cervello misurata lungo tale distanza 100) (37) (Fig. 4).

Corpo Calloso

Sulla sezione sagittale mediana prima descritta si è proceduto alla misurazione del diametro antero-posteriore, misurato lungo la linea che unisce il punto più anteriore del genu al punto più estremo dello splenium (A-P) (38,39) (Fig. 1).

Setto pellucido

Le misurazioni del setto pellucido sono state eseguite sulle sezioni coronali DP pesate perché ne consentono una migliore visualizzazione morfologica. Il punto di repere per il setto è stata la visualizzazione, in sezione coronale, della cisterna pentagonale immediatamente visibile posteriormente al chiasma ottico. Su queste immagini sono state misurate in millimetri: l'altezza del setto (h); lo spessore apicale del setto (SA); lo spessore medio del setto (SM) individuato come quello relativo al punto di mezzo dell'altezza e lo spessore basale (SB) (Fig. 2).

Cervelletto

Sulla sezione sagittale mediana è stato misurato il diametro del IV ventricolo (IVV) corrispondente alla distanza tra il vertice del IV ventricolo ed il punto di mezzo del pavimento dello stesso, ottenendo così una misura dell'ampiezza ventricolare; al fine di considerare la variabilità dell'ampiezza cranica nell'ambito del campione, è stata misurata anche la distanza tra il vertice del IV ventricolo ed il punto incontrato dal prolungamento della precedente linea sulla superficie intracranica; è stato, poi, misurato il diametro del verme cerebellare superiore (CS) inteso come la distanza tra il vertice del IV ventricolo ed il punto di massima ampiezza dei lobuli I-V; si è poi misurata la distanza tra il vertice del IV ventricolo ed il punto incontrato dalla linea di continuazione del diametro del verme cerebellare superiore sulla superficie intracranica; a tale grandezza è stato dato il nome di diametro cerebrale superiore (BS); è stato infine calcolato il rapporto tra diametro del verme cerebellare superiore e diametro cerebrale superiore e lo si è moltiplicato per 100, ottenendo così il parametro del Cerebellar Brain Ratio superiore (CBRs); applicando la stessa metodica ai lobuli VI-VII è stato calcolato un terzo indice, il Cerebellar Brain Ratio posteriore (CBRp); è stato infine calcolato il Cerebellar Brain Ratio inferiore (CBRi) applicando lo stesso metodo anche ai lobuli inferiori VIII-X (40) (Fig. 1).

Corteccia prefrontale

Sulla sezione sagittale mediana è stata misurata la lunghezza di quella parte della corteccia frontale che va dal polo frontale al punto più anteriore del genu (CPF) (Fig. 1).

Analisi dei dati

Al fine di studiare la correlazione tra le misure cerebrali effettuate ed i livelli plasmatici di NGF, i dati raccolti sono stati analizzati, utilizzando il coefficiente di Pearson.

Risultati

I livelli medi plasmatici di NGF nel campione in studio sono risultati pari a 14,91 pg/ml (range: 2,5-98 pg/ml; DS = 23,63).

Le misure dell'amigdala, dell'ippocampo e del Giro Temporale Superiore Anteriore con i relativi valori (minimi, massimi, medi e di DS) sono indicati in Tabella II; in Tabella III sono indicati i valori delle misurazioni dei gangli della base con i relativi indici; in Tabella IV sono indicate le misurazioni del corpo calloso, setto pellucido e corteccia prefrontale; in Tabella V sono elencate le misurazioni lineari e gli indici cerebellari.

È emersa una correlazione positiva significativa tra livelli medi plasmatici di NGF e due diametri cerebellari: il diametro del verme cerebellare superiore (p = .0249) ed il diametro del verme cerebellare posteriore (p = .0082). Nessuna correlazione è emersa tra livelli plasmatici di NGF e le altre misure cerebrali valutate, così come tra livelli plasmatici di NGF ed età di insorgenza della malattia (p = .39).

Discussione

I risultati del nostro studio, il primo, per quanto ci è dato conoscere, sui possibili rapporti tra morfologia cerebrale nella schizofrenia e livelli plasmatici di NGF, sono a favore di una correlazione tra questi ultimi ed un'area cerebrale, il cervelletto, più volte supposta come implicata in questa sindrome. Le funzioni cognitive del cervelletto, come organo implicato nel circuito cognitivo fronto-talamo cerebellare, e le sue potenziali implicazioni nella schizofrenia sono ben note (per un approfondimento si fa riferimento alla nota bibliografica 15). In un nostro recente lavoro abbiamo visto come il diametro cerebellare posteriore risulti significativamente ridotto rispetto a quello dei controlli sani (p = .013) e che tale misura è correlata in maniera significativa con la sottoscala della PANSS "Sintomi positivi" (p = .035) e con l'item "Deliri" di questa sottoscala (p = .006) (40).

Per quanto concerne i livelli medi plasmatici di NGF, il nostro campione conferma i risultati ottenuti nel nostro precedente lavoro in cui avevamo osservato più bassi livelli di NGF nei soggetti schizofrenici adulti rispetto ai soggetti sani (32). Pur essendo, dunque, il presente uno studio condotto necessariamente senza gruppo di controllo, i livelli medi plasmatici di NGF riscontrati nel campione di schizofrenici da noi studiato, risultano essere più bassi di quelli presenti in gruppi di controllo sani, bassi tanto quanto quelli misurati in altri gruppi di soggetti con schizofrenia studiati in precedenza (32).

Non è facile interpretare i risultati ottenuti. È noto che in modelli animali il NGF, così come altre neurotrofine (BDNF, NT3 e NT4/5), è implicato nello sviluppo del cervelletto dove, a differenza di altre aree cerebrali (corteccia cerebrale, ippocampo, ipotalamo e talamo), è presente in concentrazione più bassa (41). Dato interessante è che i recettori per il NGF sulle cellule di Purkinje, sulle cellule granulari e a livello delle cellule dei nuclei cerebellari sono presenti in densità elevata durante le prime fasi dello sviluppo cerebrale prenatale per diminuire in modo drastico nelle ultime fasi dello sviluppo fetale. Questa osservazione, proveniente da studi su roditori e su scimmie, fa ipotizzare per il NGF un ruolo nelle primissime fasi dello sviluppo cerebellare (42). Il dato che il NGF nel cervelletto seguirebbe una precisa distribuzione topografica con maggiori concentrazioni a livello dell'archicerebellum e del neocerebellum, oltre a far pensare ad un ruolo del NGF nel controllo vestibolare e motorio, ne suggerirebbe una implicazione nelle funzioni cognitive (43), essendo queste aree cerebellari implicate nel cosiddetto "controllo" cognitivo.

Alla luce di questi dati, i ridotti livelli di NGF potrebbero essere interpretati come fattori contribuenti alla riduzione delle misure lineari del lobo medio cerebellare. Per contro, è anche possibile ipotizzare che i ridotti livelli di NGF siano la risultante di alterazioni a livello di altre aree cerebrali in cui il NGF viene sintetizzato in grande quantità (ippocampo, corteccia frontale, talamo) e che l'alterazione a carico del cervelletto, mediata dai bassi livelli di NGF, costituirebbe la conseguenza di una alterazione presente in un'altra area cerebrale. A favore di questa seconda ipotesi vi sono i risultati a carico del BDNF che ricoprirebbe, nel cervelletto, non solo una funzione trofica ma anche una funzione target per le fibre muschiate pontocerebellari agenti soprattutto sulle cellule granulari (44).

Oltre ad una funzione trofica, il NGF nel cervelletto svolge anche una funzione protettiva nei riguardi della degenerazione alcolica; il cervelletto viene infatti utilizzato come modello per studiare la riduzione cellulare che l'alcol provoca. È stato dimostrato che il NGF protegge le cellule granulari cerebellari dall'azione nociva dell'alcol (45). Il nostro risultato potrebbe, quindi, essere interpretato alla luce di tale osservazione. I ridotti livelli di NGF non permetterebbero alla neurotrofina di svolgere una azione protettiva sul cervelletto contro i danni provocati da eventuali agenti infettivi, tossici o stressanti nelle prime fasi dello sviluppo cerebrale; è anche ipotizzabile che entrambi i fenomeni, "atrofia" cerebellare e ridotti livelli di NGF, possano essere l'effetto di uno stesso agente eziologico "neurotossico".

Resta da spiegare il fatto che i risultati dello studio si riferiscono ad una osservazione eseguita in un periodo lontano da quello critico in cui i diversi fattori avrebbero contribuito a determinare le alterazioni morfologiche osservate attualmente. È questo un limite dello studio, comune, tuttavia, a tutti gli altri studi di brain imaging strutturale. Una possibile soluzione di questo problema metodologico potrebbe essere offerta dalla ricerca di base con la costruzione di modelli animali in cui ricostruire le probabili condizioni di un cervello "debole" al fine di studiare, senza gli ovvi limiti della sperimentazione umana, gli specifici meccanismi patogenetici implicati nella sindrome schizofrenica (13,46).

Conclusioni

Il nostro studio è il primo, a nostra conoscenza, sulle correlazioni tra morfologia cerebrale e livelli plasmatici di NGF nell'uomo. La possibilità di interpretare l'origine di alterazioni cerebrali in rapporto all'attività delle neurotrofine contribuisce a verificare l'ipotesi del maldevelopment nella schizofrenia attraverso un approccio metodologico in cui i dati strutturali vengono confrontati con quelli neurochimici e funzionali. Numerosi sono i problemi, anche di natura concettuale, che i risultati di questo studio di correlazione interna mostrano. Tuttavia, esso apre la strada per un approfondimento necessario delle conoscenze relative al ruolo non secondario che le neurotrofine svolgono, non solo durante lo sviluppo ma anche in età adulta, nei processi di sviluppo e di funzionamento cerebrale.