Parole chiave: Indicatori piastrinici • Recettori adrenergici alfa2 • Depressione maggiore • Sintomatologia depressiva • Scala di Hamilton per la valutazione della depressione (HAM-D)
Key words: Platelet markers • Alpha2 adrenergic receptors • Major depression • Depressive symptoms • Hamilton Depression Rating Scale (HAM-D)
Introduzione
Le prime teorie etiopatogenetiche dei disturbi dell’umore risalgono agli inizi degli anni ’60, poco dopo la scoperta e l’introduzione in terapia dei primi antidepressivi triciclici ed inibitori delle monoamine ossidasi (IMAO). L’ipotesi di un deficit catecolaminergico nella depressione, che si ampliò fino a comprendere anche quello delle indoleamine (serotonina, 5-HT), dopo l’iniziale formulazione, fu suffragata anche dalle osservazioni che la reserpina, una sostanza in grado di indurre stati depressivi, in vitro provoca deplezione di neurotrasmettitori, mentre l’anfetamina, che ha proprietà euforizzanti, aumentava il rilascio di noradrenalina (NA) (16,20).
Accanto ai dati più propriamente farmacologici, si è andata accumulando tutta una serie di ricerche volte ad evidenziare alterazioni di parametri noradrenergici nei pazienti depressi in tessuti cerebrali autoptici, nel liquor, nelle urine, nel plasma e nelle piastrine ematiche.
I dati derivanti dallo studio dei livelli cerebrali di NA o dei suoi metaboliti non sembrano evidenziare nessuna alterazione, mentre è stata rilevata una maggiore densità di recettori beta-adrenergici in pazienti depressi, rispetto a soggetti sani di controllo (19). Si tratta comunque di ricerche metodologicamente discutibili ed in cui sono stati inseriti pazienti che avevano commesso un suicidio. Recentemente, è stata dimostrata la presenza di una riduzione numerica del trasportatore per la noradrenalina a livello del locus coeruleus di soggetti depressi (2,15).
Anche gli studi liquorali non consentono di trarre conclusioni definitive per quanto riguarda sia la NA che l’acido metossi-idrossi-fenilglicole (MHPG), suo metabolita, essendo state di volta in volta riportate in pazienti depressi concentrazioni aumentate, ridotte o non diverse da quelle dei soggetti di controllo, a sottolineare probabilmente l’eterogeneità del coinvogimento del sistema noradrenergico nella patologia depressiva (30,14).
Gli studi urinari hanno fornito interessanti informazioni, fin dalla metà degli anni ’60 con particolare riguardo alle concentrazioni di MHPG. Uno dei dati più replicati in psichiatra biologica, infatti, è la ridotta escrezione urinaria di MHPG, soprattutto nei depressi bipolari (17). I livelli urinari di tale metabolita sarebbero stabili nel corso di diversi episodi depressivi e potrebbero, forse, rappresentare un marker stato-dipendente. Nei pazienti bipolari, i passaggi dalla fase depressiva a quella eutimica o maniacale sarebbero accompagnati da un parallelo aumento delle concentrazioni di MHPG (24).
Sebbene i risultati non siano tutti univoci, i livelli plasmatici di NA vengono riportati essenzialmente aumentati nei depressi, unipolari o con melanconia, mentre a carico del MHPG i risultati sono estremamente dispersi (31).
Per quanto riguarda i recettori adrenergici, ne esistono 10 raggruppati in due famiglie denominate a e b, comprendenti diversi sottotipi: a1 (A- B- C- D), a2 (A/D- B- C) e b (1,2,3). Studi sull’animale avevano evidenziato già a partire dagli anni ’80 che un trattamento cronico con desipramina provocava una riduzione della sensitività dei recettori a2-adrenergici (33) e si era sviluppata l’ipotesi che una condizione di “supersensitività” dei recettori a2-adrenergici ridurrebbe l’attività del locus coeruleus e provocherebbe una ridotta funzinalità della neurotrasmissione noradrenergica, come supportato anche da dati successivi in tessuti cerebrali postmortem (23,5). Più di recente, si è preferito parlare di “disregolazione” noradrenergica nella depressione (4,29).
La presenza di recettori b ed a-adrenergici sulle piastrine ematiche, con caratteristiche farmacologiche analoghe a quelle delle omologhe strutture cerebrali, ha consentito tutta una serie di studi in vivo. I recettori a2-adrenergici piastrinici, valutati con la clonidina triziata ([3H]clonidina), sembrerebbero aumentati nei depressi rispetto soggetti di controllo (9). Al contrario, la misurazione degli stessi con altri ligandi radioattivi, quali yohimbina, rauwolscina o diidroergocriptina, non ha invece consentito di rilevare nessuna differenza tra i due gruppi (27).
Dati i risultati estremamente controversi esistenti in Letteratura, con la nostra ricerca ci siamo proposti di valutare i recettori a2-adrenergici in piastrine di pazienti depressi ambulatoriali rispetto a soggetti di controllo sani, attraverso il binding specifico della [3H]rauwolscina, antagonista altamente selettivo per tale sottotipo recettoriale. Sono state, inoltre, indagate le eventuali correlazioni tra parametri cinetici del binding della [3H]rauwolscina e sintomatologia depressiva, misurata con la scala di Hamilton per la depressione.
Soggetti e Metodi
Sono stati inseriti nella ricerca 15 pazienti ambulatoriali (8 di sesso femminile e 7 di sesso maschile, di età compresa tra 19 e 52 anni, media � DS: 34,8 � 11,5) affetti da episodio depressivo maggiore, secondo i criteri del DSM IV (1), reclutati presso la Sezione di Psichiatria del Dipartimento di Psichiatria, Neurobiologia, Farmacologia e Biotecnologie dell’Università di Pisa. Sei pazienti erano affetti da depressione unipolare, 7 da disturbo bipolare di tipo 2 e 2 da distimia. Una paziente presentava comorbidità con disturbo ossessivo-compulsivo ed un’altra con bulimia nervosa. Nessun paziente assumeva antidepressivi triciclici, 3 avevano assunto inibitori selettivi del reuptake della 5-HT (sertralina, fluvoxamina e paroxetina) 15 giorni prima del prelievo e 2 bipolari II stavano prendendo stabilizzanti dell’umore (acido valproico e gabapentina).
I pazienti sono stati confrontati ad un gruppo di 11 soggetti di controllo sani (6 di sesso femminile e 5 di sesso maschile, di età compresa tra 19 e 43 anni, media � DS: 29,8 � 10,7) con un’anamnesi personale e familiare negativa per disturbi psichiatrici maggiori.
La gravità della sintomatologia depressiva è stata valutata con la scala di Hamilton per la depressione (HAM-D)(11): il punteggio totale era compreso tra 14 e 33 (media � DS: 20,1 � 5,8) nei pazienti e tra 0 e 3 (media � DS: 1,2 � 0.8) nei soggetti di controllo.
Sia i pazienti che i soggetti sani di controllo non presentavano evidenze di patologie somatiche rilevanti.
Tutti i soggetti hanno dato il consenso scritto ad essere inseriti nello studio.
Preparazione delle membrane piastriniche
Il sangue venoso (25 ml) è stato prelevato fra le ore 8.00 e le ore 9.00 del mattino nei mesi di novembre e dicembre ai soggetti digiuni e miscelato con 3 ml di anticoagulante: citrato di sodio (2,2%) e acido citrico (1,2%). Il plasma ricco di piastrine (PRP) è stato ottenuto con una centrifugazione a bassa velocità (150 g per 15 min. a 20�C). Le piastrine sono state separate dal PRP con una centrifugazione a 1500xg per 15 min. a 20�C e conservate a -80�C fino al momento del dosaggio di binding. Le piastrine sono state omogeneizzate con ultrathurrax in 10 ml di tampone Tris-HCl 50 mM a pH 7.7 e EDTA 5 mM, contenente inibitori delle proteasi (inibitore della tripsina 20 mg/ml, bacitracina 200 mg/ml, benzamidina 160 mg/ml) e sottoposte a centrifugazione a 48000xg per 15 min. a 4�C. Il precipitato risultante è stato risospeso in 10 ml di tampone Tris-HCl 50 mM a pH 7.7 contenente EDTA 5 mM e lavato 2 volte tramite centrifugazione (48000xg per 15 min. a 4�C). Il precipitato finale è stato poi sospeso nel tampone di dosaggio (Tris HCl 50 mM).
Binding della [3H]rauwolscina
Il binding della [3H]rauwolscina è stato effettuato secondo il metodo di Corsaro et al. (6). Le membrane piastriniche (0,2-0,5 mg di proteine), sospese nel tampone di dosaggio, sono state incubate in presenza di [3H]rauwolscina (NEN, UK, attività specifica: 71 Ci/mmol) 0,5 nM per 60 min. a 25�C in un volume finale 1 ml. Il legame specifico è stato valutato in presenza di clonidina fredda 10 mM (Sigma, Milano). Le curve di saturazione sono state eseguite incubando la [3H]rauwolscina a 8 concentrazioni nel range da 0,1 a 5 nM. Dopo 60 min., l’incubazione è stata bloccata con l’aggiunta di 5 ml di tampone freddo. I campioni sono stati immediatamente filtrati attraverso filtri in fibra di vetro Whatman GF/C; i filtri sono stati lavati quattro volte con 5 ml di tampone freddo e trasferiti in vials contenenti 4 ml di liquido di scintillazione. La radioattività è stata misurata in uno scintillatore in fase liquida Packard 1600 TR.
La concentrazione nelle proteine è stata determinata in accordo al metodo di Lowry come da Peterson (25).
I dati di binding relativi all’equilibrio di saturazione, densità massima di legame (Bmax, fmol/mg) e costante di dissociazione (Kd, nM) sono stati analizzati con il programma computerizzato EBDA (21).
Analisi statistiche
Le differenze tra i valori di Bmax e Kd di pazienti e controlli sono state analizzate con il test di Student per dati non appaiati e l’effetto di sesso ed età sui parametri biologici con l’analisi di covarianza (ANCOVA). Le correlazioni tra parametri biologici e demografici/psicopatologici sono state analizzate con il metodo di Pearson. Tutte le analisi sono state effettuate tramite programmi computerizzati (Statview V per McIntosh, 1994).
Risultati
Non sono state rilevate differenze significative tra pazienti e controlli per quanto riguarda l’età ed il sesso e tali parametri non influenzavano il binding della [3H]rauwolscina.
Come evidenziato nella Tabella I e nella Figura 1, i valori di Bmax e Kd non erano statisticamente diversi tra pazienti e controlli: infatti la Bmax (fmol/mg proteine) era 168 � 33 nei pazienti e 168 � 42 nei soggetti di controllo e la Kd (nM) era 0,68 � 0,2 e 0,77 � 0,2, rispettivamente nei pazienti e nei controlli (Fig. 1).
L’analisi delle correlazioni ha rivelato la presenza di una correlazione statisticamente significativa e positiva tra i valori di Bmax ed il punteggio totale della scala HAM-D nei pazienti: maggiore il valore di Bmax, maggiore il punteggio della scala (r2: 0,25; p < 0,05) (Fig. 2).
Conclusione
I risultati principali del nostro studio hanno evidenziato che un gruppo di pazienti ambulatoriali affetti da depressione maggiore non presentava differenze significative nei parametri cinetici (Bmax, una misura della densità recettoriale, e Kd, l’inverso dell’affinità di legame) del binding della [3H]rauwolscina, utilizzato per marcare i recettori piastrinici a2-adrenergici, rispetto ad un gruppo di soggetti sani. I valori di Bmax, tuttavia, correlavano significativamente e positivamente con il punteggio totale della scala di Hamilton per la depressione, vale a dire, maggiore era il numero di recettori, maggiore risultava la gravità globale della sintomatologia depressiva. Nessuno dei nostri pazienti assumeva antidepressivi triciclici, composti in grado di modificare il binding della [3H]rauwolscina (33,10), ma solo inibitori selettivi del reuptake della 5-HT che non sembrano produrre nessun effetto a livello dei recettori a2-adrenergici (18): tali pazienti erano stati, comunque, sottoposti ad un “wash-out” farmacologico di 15 giorni. Due pazienti bipolari assumevano acido valproico e gabapentina, composti che non influenzano i recettori a2-adrenergici (18).
I nostri dati relativi al binding della [3H]rauwolscina sono in accordo alla maggior parte degli studi precedenti (28,32). Più di recente è stata rilevata una riduzione del binding della [3H]rauwolscina in pazienti sottoposti ad un più breve “wash-out” farmacologico rispetto a quello dei pazienti del presente studio ed utilizzando una metodica leggermente diversa dalla nostra (18).
Senza differenze significative tra pazienti e controlli è risultato in genere il binding della [3H]yohimbina che, come la rauwolscina è un antagonista a2- adrenergico (7,3,13), tranne che in uno studio (22).
Utilizzando, invece, agonisti parziali come la clonidina e la para-aminoclonidina, molti autori hanno rilevato un aumento della densità recettoriale nella depressione (9,10): tali composti, però, non sono selettivi, ma si legano con alta affinità anche a siti non correlati alle catecolamine, come i recettori imidazolinici (26) e con diversa affinità ai recettori a2- adrenergici a bassa ed alta affinità, mentre gli antagonisti si legano con elevata affinità a tutti i recettori a2- adrenergici.
Molto contrastanti risultano i dati relativi al binding della [3H]diidro-ergocriptina, un antagonista a2-adrenergico dotato di scarsissima selettività (34,12).
Il risultato più interessante che emerge dal nostro studio è senz’altro il rilievo della presenza di una correlazione positiva tra numero dei recettori a2-adrenergici e gravità della sintomatologia depressiva, misurata con il punteggio totale della scala di Hamilton per la depressione: si tratta della prima dimostrazione di un rapporto tra un parametro noradrenergico ed uno clinico in pazienti depressi. Quindi, anche se i recettori a2-adrenergici non si modificano in corso di depressione, il loro numero appare significativamente correlato alla sintomatologia depressiva.
Sono, comunque, necessari studi ulteriori in campioni più ampi di pazienti per confermare questa osservazione ed, eventualmente, identificare i sintomi specifici maggiormente correlati al parametro noradrenergico, così come per verificare l’effetto delle terapie antidepressive ed i cambiamenti sintomatologici a questo livello.
Tab. I. Parametri cinetici (Bmax e Kd, media � DS) del binding della [3H]rauwolscina e punteggio totale alla scala di Hamilton della depressione (HAM-D, media � DS) in pazienti ambulatoriali affetti da depressione maggiore e soggetti di controllo sani. [3H]rauwolscine binding kinetic measures (Bmax and Kd, mean � DS) and total scores on the Hamilton Depression Rating Scale (HAM-D, media � DS) in outpatients with major depression and healthy control subjects.
|
Bmax |
Kd |
HAM-D |
|
| Pazienti |
168 � |
0,68 � |
20,1 � |
| depressi |
43 |
0,2 |
5,8 |
| Controlli |
168 � |
0,77 � |
1,2 � |
|
42 |
0,2 |
0,8 |
Bmax = fmol/mg protein
Kd = nM
Fig 2. Correlazione tra Bmax del binding piastrinisco della [3H]rauwolscina e punteggio totale della scala di Hamilton per la depressione (HAM-D) in pazienti depressi. Correlation between platelet [3H]rauwolscine binding (Bmax) and total scores on the Hamilton Depression Rating Scale (HAM-D) in depressed patients.
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